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14/10/2020 / Guillermo Rodríguez

Capítulo general sobre la prueba de FCr adoptado por la Comisión de la Farmacopea Europea

El ensayo de factor C recombinante (FCr) se ha desarrollado para ayudar a aliviar las presiones de una creciente demanda del ensayo de lisado de amebocitos del Limulus (LAL). En este documento, Sven Deutschmann y Johannes Reich exponen las ventajas del FCr y su reciente reconocimiento por la Farmacopea Europea como una prueba alternativa de endotoxinas.

En noviembre  de 2019, la Comisión de la Farmacopea Europea (Ph. Eur.) aprobó 13 monografías nuevas y cuatro capítulos generales nuevos. Entre los nuevos capítulos se encuentra el Capítulo 2.6.32, titulado ‘Test for bacterial endotoxins using recombinant factor C’ (Prueba de endotoxinas bacterianas utilizando el factor C recombinante) (2.6.32), que se publicará en las próximas semanas en el suplemento de la Farmacopea Europea 10.3 y estará disponible en la página web de la Dirección Europea de Calidad del Medicamento (EDQM). El capítulo entrará en vigor a principios del próximo año (1 de enero de 2021).

En enero de 2019, la Farmacopea Europea planteó una consulta pública para preparar el nuevo capítulo general y fue la primera farmacopea en hacer referencia a la prueba de FCr, lo que hicieron en el capítulo 5.1.10, ‘Guidelines for using the test for bacterial endotoxins’ (Directrices para usar las pruebas de endotoxinas bacterianas):

“Como se indica en los Avisos generales, los métodos de ensayo que figuran en las monografías y  los capítulos generales han sido validados de conformidad con la práctica científica  aceptada  y las recomendaciones actuales sobre la validación analítica. En consecuencia, los  métodos  descritos en los capítulos generales 2.6.14. Bacterial endotoxins (Endotoxinas bacterianas), 2.6.30. Monocyte-activation test (Prueba de activación de monocitos) y 2.6.32. Test for bacterial endotoxins using recombinant factor (Prueba de endotoxinas bacterianas usando factor C recombinante), no tienen que revalidarse, salvo en consideración a su uso para una sustancia o producto específico en un entorno analítico determinado”.

Por lo tanto, se permite que la proteína recombinante se utilice como alternativa al ensayo de lisado de amebocitos del Limulus (ensayo LAL). Por ahora, en el nuevo capítulo solo se describen las pruebas basadas en el método de prueba fluorométrica, ya que se trata de los kits de FCr disponibles actualmente en el mercado europeo y la mayoría de los datos científicos disponibles se basan en este método.

 

Ventajas del FCr - mejoras en el paradigma de LAL

Las ventajas de la prueba de FCr giran en torno al cambio de paradigma más reciente: la dificultad asociada con el mantenimiento y la mejora de los métodos de prueba modernos a raíz del declive de la población de cangrejos herradura. Se reconoce que la prueba de FCr posee varias ventajas frente al ensayo de LAL, entre ellas:

a) Reproducibilidad/calidad.

b) Sostenibilidad/ disponibilidad.

c) Especificidad.

  • Reproducibilidad/calidad

Los ensayos clásicos del LAL proceden de los cangrejos herradura y, por lo tanto, varían por su naturaleza de un lote a otro. Se ha demostrado que los diferentes lotes de producción de FCr mantienen sus atributos de calidad en cuanto a los valores de la curva estándar y los parámetros obtenidos prueba tras prueba.

La producción biotecnológica de FCr permite a los usuarios obtener un producto estandarizado que no está sujeto a las variables de las proteínas obtenidas de forma natural. Esto es importante para que las pruebas sean reproducibles y fiables. La variabilidad del producto que se produce con los lotes agrupados de animales incluye la edad, el sexo, el tamaño, el entorno, etc. Las empresas multinacionales prefieren la uniformidad y las plataformas normalizadas que  se aplican en las cadenas de suministro de todo el mundo. Por lo tanto, un producto recombinante puede cumplir este criterio.

  • Sostenibilidad/disponibilidad

El FCr es un producto creado mediante biotecnología, por lo que, a diferencia de cuando se obtiene de una criatura marina con problemas de supervivencia, se puede producir ‘a voluntad’ en cultivos celulares. El género Limulus figura como ‘vulnerable’ en EEUU y el género Tachypleus figura como ‘en peligro’ en Asia, en la lista roja de la UICN (www.iucnredlist.org).

Hasta la fecha, la disponibilidad mundial del LAL se ha basado en una cadena de suministro que depende de una producción geográficamente aislada y la posterior exportación transatlántica del LAL desde la costa este de EEUU. A menor escala, también se ha utilizado el lisado de amebocitos del Tachypleus (TAL) producido localmente en Asia. La producción ‘a voluntad’ de un reactivo recombinante puede ayudar a satisfacer las demandas logísticas de las cadenas de suministro mundiales.

  • Especificidad

A diferencia del LAL, el FCr no contiene factor G, el zimógeno del betaglucano (biosensor para el betaglucano). El betaglucano se ha detectado comúnmente como un producto de descomposición de los filtros celulósicos en los procesos de fabricación, así como un contaminante omnipresente en las aguas naturales (lagos, ríos y alcantarillas) como subproducto del crecimiento de plantas y hongos. La activación del LAL por los betaglucanos se considera ‘falso positivo’. Incluso cuando está enmascarado con el tampón de bloqueo de betaglucano, se ha demostrado que afecta a la variabilidad de los resultados del ensayo de LAL. La ausencia de resultados falsos positivos en las pruebas de FCr es otra ventaja y elimina un elemento de confusión de la detección del LAL.

En las últimas décadas se han publicado innumerables artículos científicos que muestran la detección fiable y sostenible de endotoxinas bacterianas mediante ensayos basados en el FCr. En comparación, la equivalencia de los métodos del FCr y el LAL ha quedado ampliamente demostrada y las diferentes farmacopeas están empezando a incluir el FCr en sus textos oficiales.

En conjunto, las ventajas de pasar de las pruebas de endotoxinas bacterianas basadas en el LAL a las basadas en el FCr han sido claramente identificadas por los diferentes organismos reguladores. La Farmacopea Europea publicará un nuevo Capítulo General, titulado ‘Test for bacterial endotoxins using recombinant factor C’ (Prueba de endotoxinas bacterianas con el factor C recombinante) (2.6.32) en julio de 2020. Hoy en día, en EEUU se incluyó un proyecto de revisión de la USP <85> Bacterial Endotoxin Test (Pruebas de endotoxinas bacterianas) que contenía la descripción de ambos métodos, FCr y LAL, para solicitar los comentarios de los usuarios hasta diciembre de 2019. En Asia-Pacífico, las Farmacopeas Japonesa y China han adoptado el mismo enfoque para incluir el FCr en la próxima versión

 

El FCr como continuación de los paradigmas históricos del LAL

Cualquier visión del ‘futuro’ de las pruebas contiene elementos extrapolados del pasado. Existen tres elementos principales que predicen un resultado positivo para el factor C recombinante (FCr) que requieren muy poca extrapolación:

  1. El advenimiento de la biotecnología y la sustitución de las proteínas animales mediante la clonación de los genes animales necesarios (insulina, hormona de crecimiento, etc.) y la producción en biorreactores mediante organismos unicelulares nos ha proporcionado medicamentos y curas avanzados para muchas enfermedades y, por tanto, sirve como paradigma de éxito para la sustitución.
  2. Ya se han demostrado la especificidad, sensibilidad y mayor utilidad en el uso de los métodos de FCr.
  3. El uso continuado de los cangrejos herradura obtenidos en lugares geográficos limitados no es sostenible y los fabricantes farmacéuticos querrán prepararse para ese cambio.

Es importante ver el FCr como una continuación del paradigma de pruebas de LAL. Desde el uso exploratorio inicial del LAL para pruebas radiofarmacéuticas (1), en los últimos 50 años se han establecido varios paradigmas ampliamente aceptados, entre ellos:

  1. Uso de la prueba de LAL para reemplazar la prueba de pirógenos en conejos (RPT) como método para prevenir las reacciones febriles en pacientes sometidos a tratamientos con fármacos inyectables. La detección de ‘todos los pirógenos’ no era un objetivo particularmente sensible ni relevante para los fármacos inyectables, ya que estos son un producto de la fabricación a base de agua, donde los bacilos gramnegativos son el contaminante predominante.
  2. Inicialmente, el control de calidad consistía en realizar únicamente las pruebas con el producto final de los fármacos terminados. Con la llegada de una prueba in vitro más cómoda, el LAL impuso rápidamente y, a lo largo de los años, las pruebas se han expandido desde solamente el punto final hasta la materia prima, el proceso, las aguas purificadas, así como las pruebas de liberación del punto final. Este aumento de la cobertura de las pruebas de todo el proceso de fabricación ha dado lugar a un gran aumento de la seguridad microbiológica de los productos farmacéuticos.
  3. El aumento del volumen de las pruebas (tanto a nivel nacional como mundial) ha ido acompañado de la desaparición de la fuente de reactivos. Los cangrejos herradura de la costa este de EEUU (Limulus) figuran como ‘vulnerables’ y los de Asia (Tachypleus) ahora figuran oficialmente como ‘en peligro’.

Aunque la mayoría está de acuerdo en que las sangrías biomédicas no han sido la causa de tal declive, el sector debe afrontar el hecho de que se necesitan métodos sostenibles para reemplazar las pruebas de LAL.

Un nuevo cambio de paradigma que se ha producido recientemente es la llegada de las pruebas ‘fáciles de usar’. La prueba LAL comenzó como una tarea que requería bastante trabajo por parte del usuario, como por ejemplo la inversión manual de los tubos de reacción para la prueba de los coágulos de gel. Posteriormente evolucionó para convertirse en la primera prueba cinética semiautomática en la que la absorbancia se controla a lo largo del tiempo sin más intervención del usuario y, por último, a configuraciones en las que los estándares y los reactivos de la prueba se combinan en un único kit (prueba de cartuchos y placas previamente recubiertas). Cada cambio de paradigma ha ayudado al sector farmacéutico al hacer que los casos de contaminación de productos sean poco frecuentes (2).

Hoy en día se espera que, por razones de sostenibilidad, las empresas farmacéuticas de todo el mundo estudien el uso del FCr en los ensayos rutinarios del agua purificada, las materias primas, los componentes y los productos farmacéuticos terminados. La Administración de Alimentos y Fármacos de EEUU (FDA) se ha mostrado receptiva a tal cambio, como se ha visto en la reciente aprobación del primer fármaco liberado mediante FCr. Muchas empresas multinacionales están realizando pruebas en materias primas, agua y componentes con el FCr.

Hay algunos en el sector que se preocupan por el legado del LAL. Sin embargo, la adopción de métodos recombinantes debe considerarse como una mejora de ese legado y no como una afrenta a este, al igual que el cambio de las proteínas medicinales de origen animal, como la insulina humana recombinante, no fue una afrenta a las primeras iniciativas (insulina de origen animal) para tratar la enfermedad. De hecho, la revolución biotecnológica es una respuesta directa a la utilidad reconocida de las proteínas naturales.

Bibliografía   

  1. Cooper, Levin, Wagner. New rapid in vitro test for pyrogen in short-lived radiopharmaceuticals. J. Nucl. Med. 1970; 11:310.
  2. Endotoxin-like reactions associated with intravenous gentamicin- California, Morb. Mortal. Weekly Report, 1998, 47(41); p. 877-880.
Datos del autor
Nombre Sven Deutschmann y Johannes Reich
Empresa Roche Diagnosis GmbH y Microcoat, respectivamente
Cargo Jefe de Ciencia Analítica y Tecnología Global y director general
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