SECUENCIACIÓN Figura 2. Proceso de trabajo de la SNG y requisitos específicos de la calidad del agua. pueden contaminar los equipos o depositarse en las líneas de los manipuladores de líquido. Por consiguiente, es crucial seleccionar con cuidado la calidad del agua utilizada para cada etapa del proceso de SNG (Figura 2). 1- Preparación de la biblioteca de ácidos nucleicos La preparación de bibliotecas de secuenciación de gran calidad a partir de ácidos nucleicos es crucial para obtener datos de SNG fiables. Si se utiliza un homogeneizador ultrasónico para fragmentar el ADN, se recomienda emplear agua purificada para el baño María, ya que las impurezas podrían afectar a la eficacia de la transferencia de niveles precisos de energía a la muestra. Para la cuantificación y el control de calidad de la biblioteca, pueden utilizarse electroforesis en gel, en chip o capilar. En todos los casos, la migración de la muestra con respecto a su carga depende de la calidad del agua. Además, en el caso de la electroforesis capilar, los equipos dependen de la detección de fluorescencia, que puede verse alterada por los contaminantes orgánicos. Por consiguiente, utilizar agua ultrapura para la preparación de tampones y gel para electroforesis capilar, y para diluciones, Utilizar agua ultrapura para la preparación de tampones y gel para electroforesis capilar, y para diluciones, asegurará resultados fiables asegurará resultados fiables. Además, cuando se preparan las muestras para SNG (por ejemplo, PCR, ligadura, reparación final) se realizan muchas reacciones enzimáticas, y todas dependen de la calidad del agua. 2- SNG basada en fluorescencia El proceso de secuenciación es muy sensible a cualquier actividad de nucleasa. Por ejemplo, cuando se utiliza el método de secuenciación química SOLID™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.), una pasada típica de aproximadamente dos mil millones de lecturas tarda de cinco a siete días. El efecto de la contaminación con DNAsa puede no ponerse de manifiesto durante el periodo de carga y calibración inicial, pero al cabo de una semana, la degradación de la señal puede demostrarse desastrosa para los resultados experimentales. Por esta razón, para todas las diluciones tampón y los tampones de ejecución del sistema solo debe utilizarse agua ultrapura exenta de nucleasas. Las nucleasas escinden los enlaces fosfodiester de los ácidos nucleicos. Estas resistentes enzimas están presentes en todo el entorno del laboratorio y son notoriamente difíciles de eliminar. El tratamiento del agua del laboratorio en autoclave no basta para eliminar las nucleasas. Estas enzimas pueden desnaturalizarse durante el proceso, pero son capaces de recuperar su estructura nativa y su función. En muchos casos, el agua se trata primero químicamente con dietilpirocarbonato (DEPC) y luego en autoclave para asegurar la erradicación de la actividad nucleasa. El problema con este enfoque es que el alcohol y el CO2 generado por el tratamiento químico pueden interaccionar con las reacciones enzimáticas y, por tanto, afectar a los resultados experimentales. Además, el DEPC es un producto químico peligroso y el procedimiento global de tratamiento con DEPC es largo. Un método alternativo al tratamiento del agua con DEPC es la ultrafiltración. En este proceso se utilizan fibras huecas para separar los contaminantes en función de su tamaño. En última instancia, elimina las nucleasas del agua en vez de desactivarlas simplemente. Puede conectarse un filtro de ultrafiltración (Biopak®, Merck Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) al punto de suministro de un sistema de purificación de agua. El agua ultrapura tratada mediante ultrafiltración está exenta de nucleasas. La eficiencia de la eliminación de las RNasas mediante ultrafiltración es equivalente a la inactivación de la actividad RNasa mediante tratamiento con DEPC (Figura 3), pero sin las desventajas ligadas a la generación de alcohol y CO2. 3- SNG mediante semiconductor iónico La tecnología de secuenciación Ion Torrent™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) mide la incorporación de nucleótidos mediante cambios en el pH. Esta tecnología es sensible a cualquier cambio de pH que no se deba a la extensión de la molécula de ADN, como la contaminación, los cambios de temperatura o 88 SEPTIEMBRE/OCTUBRE15 FARMESPAÑA INDUSTRIAL
Septiembre Octubre 2015
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