SECUENCIACIÓN Figura 3. Eficacia de eliminación de RNasas mediante ultrafiltración El agua ultrapura enriquecida con RNasa A 1: se trató con DEPC y luego en autoclave, o 2: se trató con ultrafiltración o 3: no se trató. Se añadió ARN ribosómico a cada disolución y se realizó electroforesis en gel. Después de tan solo una hora, la resistividad del agua ultrapura puede caer de 18 a 4 MOhm.cm. Este cambio en el pH tendría un efecto perjudicial en el proceso de secuenciación el CO2 atmosférico que se disuelve en las disoluciones de ejecución. Una pasada de ~100 millones de lecturas tarda menos de seis horas. En el manual del usuario se indica que las disoluciones deben prepararse a diario con agua ultrapura (resistividad: 18 MOhm.cm) procedente directamente de un sistema de purificación de agua, y que esta última no debe almacenarse. El agua ultrapura es un excelente disolvente. Suele contaminarse por el entorno o por los recipientes con los que está en contacto. Por ejemplo, el agua ultrapura conservada en un recipiente absorberá con gran rapidez el CO2 atmosférico para formar ácido carbónico, luego bicarbonato y carbonato; como consecuencia, el pH se volverá ácido. Después de tan solo una hora, la resistividad del agua ultrapura puede caer de 18 a 4 MOhm.cm. Este cambio en el pH tendría un efecto perjudicial en el proceso de secuenciación. Por consiguiente, para las plataformas semiconductoras iónicas de secuenciación se necesita agua recién purificada procedente de un sistema de purificación de agua. Una vez recogida, el agua es cubierta con gas nitrógeno de gran pureza para evitar la disolución del CO2 atmosférico. En MetaGenoPolis, se han completado satisfactoriamente más de veinte procesos de secuenciación Ion Proton™ (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) utilizando agua ultrapura procedente de un sistema Milli-Q® Integral (Merck Millipore, Molsheim, France). Sistemas de purificación de agua La purificación del agua se lleva a cabo de manera general en dos etapas: pretratamiento y ultrafiltración. El pretratamiento elimina la mayor cantidad de contaminantes del agua: normalmente del 95 al 99 % de todos los contaminantes. La ultrafiltración elimina las trazas de contaminantes que siguen presentes en el agua. No existe una sola tecnología que pueda eliminar fácilmente todos los contaminantes del agua. Por consiguiente, en cada una de las etapas de la purificación se utiliza una combinación de tecnologías para obtener el agua más pura posible (Figura 1). Hay dos formas frecuentes de controlar la calidad del agua de laboratorio: la resistividad y el carbono oxidable total (TOC). • La resistividad es un reflejo de la pureza iónica. El agua del grifo contiene normalmente una concentración de partes por millón, (ppm; equivalente a mg/l) de iones. Estas concentraciones caen hasta subpartes por mil millones (ppb, según la notación americana; equivalente a μg/l) después de la etapa de pretratamiento, y luego se reducen aún más, después de la etapa de ultrafiltración, hasta partes por billón (ppt, según la notación americana; equivalente a ng/l) o inferior. • El TOC es un reflejo de la extensión de la contaminación orgánica del agua. El agua del grifo suele contener contaminantes orgánicos a concentraciones de ppm. Estas concentraciones caen por debajo de 50 ppb después del pretratamiento y a menos de 5 ppb después de la etapa de ultrafiltración. Las dos etapas de purificación pueden combinarse en un solo sistema de purificación de agua, como el sistema Milli-Q® Integral. Puede colocarse otro filtro a la salida del sistema de purificación de agua, como un filtro selectivo de 0,22 μm (para retener las partículas y las bacterias) o un ultrafiltro (para retener las nucleasas y otros subproductos bacterianos) para el trabajo de secuenciación. Conclusión El agua es un reactivo esencial en la SNG y su calidad tiene un efecto directo sobre la uniformidad y la fiabilidad de los resultados de la secuenciación. Un sistema de purificación del agua bien diseñado y mantenido puede proporcionar a los laboratorios agua de gran calidad a medida para satisfacer sus necesidades específicas. Además, algunos sistemas de purificación incluyen herramientas de software específicas para usuarios que trabajan en entornos de buenas prácticas (GxP) que deben cumplir directrices como la norma 21 CFR parte 11 de la FDA o requisitos similares estipulados por otros organismos normativos globales �� FARMESPAÑA INDUSTRIAL SEPTIEMBRE/OCTUBRE15 89
Septiembre Octubre 2015
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